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基因工程是一门实用性很强的学科，涉及生命科学的多学科领域。本书以用于检测细胞凋亡的Annexin Ⅴ-EGFP为例，系统介绍了从基因***、蛋白质表达纯化、蛋白质功能检测到最后应用方面的实验方法。

本书适用于初步接触基因工程实验的高年级本科生，或从事相关研究的科研人员。

丛书序

丛书前言

第一章 Annexin Ⅴ-EGFP基因***与表达载体构建

实验1 Annexin Ⅴ表达序列检索

1.实验目的

2.实验原理

3.实验方法与结果

实验2 Annexin Ⅴ-EGFP基因***设计

1.实验目的

2.实验原理

3.实验方法

实验3 哺乳动物细胞中提取RNA

1.实验目的

2.实验原理(异硫氰酸胍酚氯仿一步法)

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

6.实验结果分析与讨论

7.思考题

实验4 逆转录PCR与产物鉴定

1.实验目的

2.实验原理

3.实验方法

4.实验步骤

5.实验结果与讨论

实验5 PCR产物的酶切与***

1.实验目的

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

实验6 ***鉴定

1.实验目的

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

实验7 大肠杆菌感受态的制备

1.实验目的与要求

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

参考文献

第二章 Annexin Ⅴ-EGFP质粒的扩增与提取

实验8 Annexin Ⅴ-EGFP质粒的扩增

1.实验目的

2.实验仪器与器材

3.试剂与配制

4.实验原理

5.实验步骤

实验9 Annexin Ⅴ-EGFP质粒的提取

1.实验目的

2.实验原理与方法

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

6.质粒提取常见问题

参考文献

第三章 Annexin Ⅴ-EGFP基因的表达与纯化

实验10 Annexin Ⅴ-EGFP基因的表达

1.实验目的

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验步骤

6.注意事项

7.讨论

8.思考题

实验11 Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白His6-EGFP-Annexin Ⅴ

1.实验目的

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验方法

6.注意事项

7.讨论

8.思考题

参考文献

第四章 Annexin Ⅴ-EGFP重组蛋白质的应用检测

实验12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

1.实验目的

2.实验原理

3.实验仪器与器材

4.试剂与配制

5.实验方法

6.注意事项

7.讨论

8.思考题

实验13 蛋白质转移印迹法检测Annexin Ⅴ-EGFP基因表达

1.实验目的

2.实验原理

3.实验试剂

4.实验仪器

5.实验步骤

6.注意事项

7.讨论

8.思考题

实验14 流式细胞仪检测凋亡细胞

1.实验目的

2.实验原理

3.实验试剂

4.实验仪器

5.实验步骤

6.注意事项

7.扩展

8.思考题

实验15 荧光显微镜检测

1.实验目的

2.实验原理

3.实验试剂

4.实验仪器

5.实验步骤

6.注意事项

7.扩展

8.思考题

参考文献

附录

1.氨基酸密码子表

2.酶切位点保护碱基表

3.SDS-PAGE分离胶配方表

4.SDS-PAGE浓缩胶配方表

5.网络资源

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第一章　AnnexinⅤ-EGFP基因***与表达载体构建

实验1　AnnexinⅤ表达序列检索

1.实验目的

学会使用Pubmed操作界面从Genebank中获取AnnexinⅤmRNA序列，并利用DNAman① 等软件对其mRNA序列进行分析，获取cDNA序列，利用引物设计软件设计扩增该cDNA的PCR引物。

2.实验原理

Annexins是一类结构与功能非常相似的蛋白家族，到目前为止，已经发现该家族至少包含13种蛋白质，其相应结构也已经解析。Annexins家族蛋白通常含有4个同源重复氨基酸序列，每个同源序列约70个氨基酸，此外，该家族蛋白还包含1个特征性的高度保守的钙离子与磷脂结合域。虽然Annexins蛋白高度同源，但其蛋白质N端的长度和序列变异较大（11～196个氨基酸不等），是发生多种蛋白质翻译后修饰的主要区域。

第一个三维结构被解析的Annexins家族蛋白是人AnnexinⅤ（1990年），其结构如图1-1所示。根据圆二定律，AnnexinⅤ结构几乎全部由α螺旋构成，这些螺旋结构

图1-1　AnnexinⅤ蛋白质结构示意图

①DNAman（5.2.2）是由LynnonBiosoft公司开发的DNA分析软件，该软件功能较强，能进行日常的DNA序列、蛋白质序列分析等。

根据同源性分别折叠成4个结构紧密的结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。每个结构域包含5个α螺旋，相互缠绕形成不多于2个转向的超螺旋结构。每个结构域中4个α螺旋呈同方向或反方向平行分布，另外1个α螺旋呈垂直分布。结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ依靠短肽相互联结。这4个结构域几乎呈环形排列，使该分子呈现局部凹凸的形状。钙离子通常结合于该蛋白质的凸面，而蛋白质N端或C端通常分布于相反的凹面。

AnnexinⅤ基因编码的蛋白质是Annexin家族蛋白之一，该蛋白质是钙依赖型磷脂结合蛋白，其中有些成员参与细胞膜相关的内吞与外排途径。AnnexinⅤ是磷脂酶A2与蛋白激酶C抑制蛋白，具有钙通道活性与细胞***传导作用，在炎症、生长与分化过程中发挥重要作用。AnnexinⅤ也被称为胎盘抗凝蛋白Ⅰ、抗血栓素α、内连素Ⅱ、脂皮质素Ⅴ、胎盘蛋白4、锚连蛋白CⅡ。该基因长29kb，包含13个外显子，编码一约1.6kb长的单转录本，分子质量约35kDa。

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V-EGFP重组蛋白质的***表达与检测)》以具体的ANNEXINV-EGFP（ANNEXINV绿色荧光蛋白）为例系统介绍基因工程中从基因***、鉴定、表达与纯化的一系列实验。让学生对基因工程实验过程有更为系统与全面的认识，激发学生学习基因工程的兴趣，并掌握基因工程中基本的知识与技能。